Micotossine. Focus sulle sostanze in via di normazione e su nuove metodiche analitiche

Micotossine. Focus sulle sostanze in via di normazione e su nuove metodiche analitiche

Micotossine emergenti e aggiornamenti normativi: Ivan Pecorelli dell’IZS dell’Umbria e delle Marche Togo Rosati ha approfondito le metodiche per identificare alcune classi di micotossine emergenti e non, di sicuro interesse tossicologico

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18

Luglio
2019

Nell’ambito delle proprie competenze, il Laboratorio di Contaminanti Ambientali dell’IZSUM ha partecipato a diversi studi collaborativi per la validazione di metodiche innovative nel settore delle micotossine. Le micotossine sono metaboliti secondari di funghi microscopici. Da un punto di vista tossicologico alcune classi sono considerate interferenti endocrini e possono essere cangerogene; per alcune invece gli effetti non sono ancora stati rilevati. Chimicamente ne sono state caratterizzate circa 300 e una quindicina sono quelle normate a livello europeo (Reg. (CE) 1881/2006).

Ivan Pecorelli, dell’Istituto Zooprofilattico Sperimentale dell’Umbria e delle Marche Togo Rosati, nel suo intervento si è concentrato sulle metodiche per identificare alcune classi di micotossine emergenti di sicuro interesse tossicologico (ed esempio Tossine di Alternaria e Alcaloidi dell'Ergot), che ancora non sono normate nel Regolamento (UE) 1881/2006 ma che lo saranno a breve.

Quando si parla di micotossine emergenti non è possibile citare una definizione univoca. Si considerano infatti appartenenti a queste gruppo:

  • Micotossine di cui non si esegue una determinazione di routine e che non hanno limiti legali (perché non ci sono riferimenti analitici o evidenze tossicologiche), ma il cui interesse è crescente (per esempio Enniatine, Beauvericina, Moniliformina, Alcaloidi dell’Ergot, Tossine di Alternaria)
  • Micotossine in forme alterate (3 Acetil DON; 15 Acetil DON)
  • Micotossine mascherate non rilevabili a causa della trasformazione da parte delle piante (glucosidi, Ocratossina alfa, 4-OH OTA, solfati) a scopo di detossificazione.

Con il progredire delle tecniche analitiche e delle evidenze scientifiche alcune classi potrebbero essere prossime a una rivalutazione.
In merito a 3 Acetil DON e a 15 Acetil DON e ai glucosidi, infatti, EFSA sta rivedendo la sua posizione e probabilmente queste sostanze verranno a breve riconsiderate, in un’ottica più generale di affinità col deossinivalenolo (DON); attualmente la normativa comunitaria contempla solo il deossinivalenolo come sostanza da ricercare e per la quale sono fissati dei limiti.
Altre due classi prossime a una regolamentazione a livello europeo sono le tossine di Alternaria e gli alcaloidi dell’Ergot.

Tossine di Alternaria

Il fungo di Alternaria può contaminare diverse tipologie di piante (in particolare cereali, semi oleosi, pomodoro e suoi derivati). Produce circa 70 fito-tossine ma poche sono state chimicamente caratterizzate. Per alcune sono stati riportati effetti teratogeni e fetotossici sull’uomo e gli animali.

Fig. 1 Tossine di alternaria

Le tossine di Alternaria sono fra i “sorvegliati speciali” dell'EFSA in ottica di valutazione del rischio (EfSA Journal 2011; 9(10):2407).

Nel 2015 il Centro comune di ricerca (JRC) della Commissione Europea ha invitato lo IZSUM allo studio collaborativo per la validazione del metodo di analisi per la determinazione attraverso spettrometria di massa di tossine di Alternaria in cereali, succo di pomodoro e semi di girasole. Attività poi ripetuta nel 2018 con una metodica parzialmente modificata, visto che nel precedente erano emerse dei limiti rispetto ad alcune matrici. Quella sperimentata nel 2018 è stata una metodica in diluizione isotopica, il cui vantaggio è quello di effettuare una calibrazione in solvente invece che in matrice post (e questo è un bene perché è praticamente impossibile trovare matrici esenti da queste sostanze).

Alcaloidi dell'Ergot

Nel 2012 l'EFSA ha emesso un’opinione in cui ha considerato una serie di molecole relative agli Alcaloidi dell’Ergot (EFSA Journal 2012; 10(7):2798). Fra tutte le sostanze prodotte da questo fungo microscopico ne sono state individuate sei (ergometrina, ergotamina, ergosina, ergocristina, ergocryptina ergocornina) e i loro epimeri (-inine). La contaminazione alimentare, da parte di questi alcaloidi (ergopeptine ed ergoamidi, cfr. fig. 2) espone l’uomo a rischi tossicologici. La struttura di base dei quattro anelli condensati del sistema ergoninico è in grado, infatti, di simulare la struttura e la funzione di neurotrasmettitori quali la norepinefrina, l’adrenalina e la serotonina, e di avere un effetto parzialmente agonistico o antagonistico sui recettori dei neurotrasmettitori stessi.

Fig.2 Struttura chimica di alcuni Alcaloidi dell’Ergot

Fra il 2017 e il 2019 il laboratorio di contaminanti ambientali dell’IZSUM è stato coinvolto nell’analisi di campioni ufficiali di monitoraggio per determinazione di queste tossine emergenti su matrici quali: cereali e derivati (Alternaria ed Ergot), pomodori e derivati (Alternaria) e semi di girasole (Alternaria) allo scopo di valutare la presenza e la diffusione delle tossine e fornire i dati all'EFSA per la valutazione del rischio. I dati analitici dei campioni degli anni 2017 e 2018 hanno restituito la seguente fotografia: nei succhi di pomodoro si è trovata nella maggioranza dei campioni una concentrazione superiore al limite di quantificazione.
Nei cereali e loro derivati sia per tossine dell’Ergot sia per quelle di Alternaria si è vista una certa diffusione, meno importante rispetto al succo di pomodoro, ma abbastanza elevata. Alcune matrici sono state trovate esenti, in altre era invece presente il panel completo degli Alcaloidi dell’Ergot, anche a concentrazioni prossime ai 100 ppb.
I semi di girasole infine sono risultati la matrice più contaminata dalle tossine ricercate.

Queste valutazioni preliminari suggeriscono l’importanza della determinazione delle micotossine emergenti per la tutela della salute pubblica. Il controllo integrato di pesticidi e micotossine potrebbe consentire la valutazione combinata del rischio ma bisogna disporre di metodiche analitiche affidabili e validate per fornire i dati all'EFSA per una completa e corretta valutazione del rischio.

Trasferimento dell’aflatossina M1 dal latte ai prodotti lattiero-caseari

Il laboratorio contaminanti di IZSUM da qualche anno sta conducendo una studio sulla determinazione sperimentale del fattore di concentrazione dell’aflatossina M1 in prodotti lattiero-caseari. Le aflatossine B1, B2, G1, G2 prodotte dal gen. Aspergillus sono sostanze molto pericolose e classificate dallo IARC in classe 1 (genotossiche e cancerogene).
L’aflatossina M1, metabolita della B1, valutata anch’essa in classe 1 dello IARC (genotossica e cancerogena), per escrezione mammaria può contaminare il latte. AFL M1 è ad oggi l’unica micotossina di importanza tossicologica in un alimento di origine animale e i limiti massimi sono fissati per legge pari a 0,050 microgrammi/kg (Reg. (CE) 1881/2006) nel latte crudo, latte trattato termicamente e latte destinato alla fabbricazione di prodotti a base latte.

Nei prodotti lattiero-caseari, invece, il Regolamento non fissa un limite normativo diretto. Nei casi di prodotti trasformati, infatti, l’analisi diretta del prodotto non può portare a una valutazione di conformità a meno di non conoscere il fattore di trasformazione. 

In assenza di norme specifiche sui prodotti lattiero-caseari quindi, il trasferimento dell’aflatossina M1 dal latte ai prodotti di trasformazione è un dato che permette di avere indicazioni sulla conformità dei prodotti derivati, anche in assenza del latte di partenza. Il Regolamento 1881/2006 nell’art. 2, per i prodotti che hanno subito una variazione di concentrazione in seguito a disidratazione, diluizione o trasformazione chiede all’OSA di fornire un fattore di trasformazione che consenta di poter ricondurre la concentrazione trovata nel prodotto trasformato a un limite fissato, dalla norma stessa, nel latte di partenza.

Per alcuni dei prodotti trasformati, come i formaggi, ricavare il fattore può riservare delle complessità. Attraverso un parere del Comitato Nazionale della sicurezza alimentare (n.13 del 10/06/2013) il Ministero della salute, sollecitato da una richiesta della Regione Umbria attraverso IZSUM, ha fissato in via provvisoria un fattore pari a 3,0, per i formaggi a pasta tenera e prodotti del siero, e a 5,5, per quelli a pasta dura, raccomandando al contempo di effettuare studi sperimentali per quanto riguarda la determinazione sperimentale dei fattori di concentrazione.

Uno dei principali problemi tuttavia si è rivelato subito essere l’inquadramento dei formaggi in categorie definite. Una prima ipotesi, ha quindi individuato cinque categorie di durezza dei formaggi definite sulla base del tasso di umidità della materia sgrassata (MFFB, Moisture content on a fat-free basis): pasta molle, semi-molle, semi-dura, dura, extra-dura (cfr. fig. 3).

Fig. 3 Valori di MFFB per la definizione della categorie di durezza di formaggi

Nei primi due anni di sperimentazione l’IZSUM ha collezionato una serie di campioni di latte (ovino e bovino) contaminati da aflatossina M1, per verificare quanto questo metabolita fosse trasferito dal latte ai derivati (Evaluation of the concentration factor of aflatoxin M1 in a semi-hard pecorino cheese obtained from naturally contaminated milk Autori: Pecorelli I, Branciari R, Ortenzi R, Ciriaci M, Checcarelli S, Roila R, Capotorti A, Spaccini G, Valiani A - Rivista: Food Control, 2018, 85, 194-198, doi.org/10.1016/j.foodcont.2017.09.026).
Quello che dallo studio sperimentale si è dedotto è che la categorizzazione dei formaggi in base alla durezza (e quindi all’MFFB) è un criterio indicativo per l’attribuzione di un coefficiente di concentrazione, mentre le conclusioni dello studio suggeriscono di considerare anche la qualità compositiva della materia prima nella definizione del coefficiente di concentrazione, in relazione alla tipologia di prodotto.

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